保护基（protecting group）是暂时"屏蔽"某一官能团活性、使其在特定反应条件下不参与反应的化学基团，在多肽合成中处于核心地位。肽链上天然存在 α-氨基、α-羧基及多种侧链官能团（Lys 的 ε-NH2、Asp/Glu 的 β/γ-COOH、Ser/Thr 的-OH、Tyr 的酚羟基、Cys 的-SH、His 的咪唑基、Arg 的胍基、Trp 的吲哚基、Asn/Gln 的酰胺、Met 的硫醚），若不加区分，偶联反应中会出现自聚、分支、消旋、氧化、环化等副反应。保护基的作用体现在三点：阻止副反应、保证每轮偶联只发生在唯一指定位点的选择性，以及提供正交性（orthogonality）——不同类别的保护基可在互不干扰的条件下分别脱除，从而实现环化、定点标记、分支肽等高级结构。实践中按功能分为三层：α-氨基临时保护基（每轮循环脱除一次）、侧链永久保护基（全程保留，切割时一次性脱除）、C 端连接臂/树脂（把肽锚定在固相载体上，最后断裂）。
α-氨基临时保护基主要有四类。Fmoc（9-芴甲氧羰基）是当前主流，用 20% 哌啶/DMF 室温处理 2 次、每次 5–10 min 脱除，脱除生成的二苯并富烯-哌啶加合物在 301 nm 有强吸收，可用于在线紫外定量监测偶联效率；Fmoc 对酸稳定，与 tBu、Boc、Trt、Pbf 完全正交。Boc（叔丁氧羰基）用于 Boc 法，以 TFA 或 50% TFA/DCM 处理 5–30 min 脱除，最终切割用无水 HF（−5 至 0 ℃，1 h）或 TFMSA；Boc 法对碱稳定，适合含 Asp-Gly 的碱敏序列。Cbz（苄氧羰基）主要用于溶液法与工业中间体，通过 H2/Pd-C 常压氢解（室温，2–6 h）或 HF、液氨/钠还原脱除。此外还有用于正交设计的特殊基团：Alloc（烯丙氧羰基）用 Pd(PPh3)4（0.1–0.2 当量）/PhSiH3（10–20 当量）在 DCM 中处理 30–60 min 脱除，对酸、碱均稳定；Dde 与 ivDde 用 2% 肼/DMF 处理 3 次、每次 3 min 脱除，ivDde 比 Dde 更稳定、不易迁移；Mtt 与 Mmt 用 1–2% TFA/DCM（含 5% TIS）处理 5 次、每次 2 min 即可选择性脱除而 tBu、Boc、Pbf 不受影响，是侧链定点修饰最常用的"把手"。
侧链永久保护基按残基归类如下。羧基侧链用 tBu（叔丁酯）：Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH；羟基侧链也用 tBu：Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH（Boc 法中对应使用 Bzl 苄基保护）。氨基侧链用 Boc：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH（Trp 用 Boc 可抑制吲哚环的叔丁基化与磺化）。巯基与咪唑基常用 Trt（三苯甲基）：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；Asn、Gln 的酰胺侧链也常用 Trt 保护以避免脱水与聚集：Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH。Arg 的胍基用磺酰基类保护基，按酸解难度排序为 Pbf（最快，2–3 h）> Pmc > Mtr（最慢，需 6 h 以上，现已少用），目前标准配置为 Fmoc-Arg(Pbf)-OH。Cys 的巯基在多二硫键肽中需正交组合：Trt（TFA 切割时脱除）、Acm（对 TFA 稳定，用 I2 或 Tl(TFA)3 氧化脱除并成环）、Mob（用 HF 或 Hg(OAc)2 脱除）、tBuThio 与 StBu（用 TCEP 或 DTT 还原脱除）。His 还可用 Boc 保护（Fmoc-His(Boc)-OH）以降低 Trt 带来的轻微消旋风险。
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正交组合的典型应用有三类。第一类是侧链环化（内酰胺桥与 stapled peptide）：在 i 与 i+4 位分别引入 Fmoc-Glu(OAll)-OH 与 Fmoc-Lys(Alloc)-OH，在树脂上先用 Pd(PPh3)4/PhSiH3 脱除 OAll 与 Alloc（30–60 min，2 次），再用 PyBOP/HOBt/DIPEA（各 2–4 当量，DMF，室温 2–4 h）完成侧链内酰胺成环，之后继续延伸，最后常规 TFA 切割。第二类是定点标记：引入 Fmoc-Lys(Mtt)-OH，合成结束后用 1–2% TFA/DCM（含 5% TIS）选择性脱除 Mtt 暴露 ε-NH2，再与 FITC（1.2 当量，DMF，避光室温 2 h）、生物素-NHS 酯、DOTA-NHS 酯或马来酰亚胺活化基团反应，最后再 TFA 切割。第三类是定向二硫键：以三对二硫键的芋螺毒素为例，分别使用 Cys(Trt)/Cys(Acm)、Cys(Trt)/Cys(Mob) 配对，TFA 切割后先空气氧化（pH 8.0，0.1 M NH4HCO3，肽浓度 0.1–0.5 mg/mL，室温 12–24 h）形成第一对，再用 I2（10 当量，50% 乙酸水溶液，室温 30 min）脱 Acm 形成第二对。需注意正交组合会提高砌块成本（Fmoc-Lys(Mtt)-OH 价格常为 Fmoc-Lys(Boc)-OH 的 2–5 倍）与工艺步骤，合成前应完成整体方案兼容性核对。
