基本性质
- 中文名称：Mca - 脯氨酸 - 亮氨酸 - 甘氨酸 - 脯氨酸 - D - 赖氨酸 (Dnp)-OH
- 简称：MCA-PLGP-D-Lys (DNP)
- CAS 号：185698-23-1
- 单字母序列：Mca-PLGP-d-K (Dnp)-OH
- 三字母序列：Mca-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Lys (Dnp)-OH
- 分子式：C₄₂H₅₂N₈O₁₄
- 分子量：892.92
- 荧光基团说明：Mca = 7 - 甲氧基香豆素 - 4 - 乙酰基（荧光供体）；Dnp = 2,4 - 二硝基苯基（荧光淬灭受体），属于经典 FRET 荧光共振能量转移底物，共 5 个氨基酸，C 端为游离羧基，含有 D-Lys 构型
- 酶靶点：Thimet 寡肽酶（Thimet oligopeptidase，TOP，EC 3.4.24.15），是 TOP 高特异性荧光底物 荧光参数：激发波长 Ex≈320 nm，发射波长 Em≈405 nm
结构特征
序列核心识别基序为 Pro-Leu-Gly-Pro，是 TOP 偏好的结合与剪切位点，酶水解位点落在 Gly-Pro 之间。N 端共价连接 Mca 荧光团，D 型赖氨酸侧链氨基上修饰 Dnp 淬灭基团；底物完整状态下，Mca 的荧光能量被邻近 Dnp 高效淬灭，几乎检测不到荧光。肽链中两处 Pro 残基引入转角结构，形成适合 TOP 活性口袋识别的刚性构象；D-Lys 的 D 构型有助于提升底物对 TOP 的选择性，降低被其他基质金属蛋白酶、寡肽酶非特异性切割的概率。
作用机理
FRET 淬灭机制：完整底物中 Mca 与 Dnp 空间距离靠近，发生荧光共振能量转移，Mca 荧光被 Dnp 淬灭。当 Thimet 寡肽酶识别并水解 Gly-Pro 肽键后，供体 Mca 片段和淬灭基团 Dnp 相互分离，FRET 效应消失，Mca 荧光恢复。荧光信号强度和酶的水解产物量呈线性相关，通过荧光读数定量 TOP 酶活。 Thimet 寡肽酶是胞质可溶性金属寡肽酶（锌依赖 M3 家族肽酶），参与神经肽、激素肽的降解代谢，在脑内肽信号调控、炎症、氧化应激、淀粉样肽代谢通路中发挥功能。该底物仅被 TOP 优先切割，对多数其他 MMP、内肽酶交叉反应很低。
应用领域
- Thimet 寡肽酶（TOP）酶活检测：体外重组 TOP、细胞裂解液、脑组织匀浆中 TOP 活性定量，高通量酶活筛选；
- TOP 抑制剂筛选平台：用于筛选 TOP 小分子、多肽抑制剂，测定 IC₅₀、Ki 动力学参数；
- 神经肽代谢研究：研究 TOP 对 Aβ、阿片肽、脑啡肽等内源神经肽的降解调控；
- 构效关系研究：TOP 底物结合口袋识别偏好、酶底物特异性改造实验；
- 神经退行性疾病机制研究：阿尔茨海默病模型中 TOP 表达与活性变化检测。
研究进展
该底物是 TOP 研究领域使用最广泛的特异性 FRET 底物，解决了早期 TOP 缺乏高选择性荧光底物、易受其他金属肽酶干扰的问题。相比于通用 MMP 荧光底物，PLGP 序列对 TOP 选择性优势突出，广泛用于 96 孔板高通量筛选。
局限性：只能用于体外生化体系，细胞内递送难度高，不能直接用于活细胞成像；Dnp 基团在还原性环境下会发生非特异性修饰，造成背景荧光升高；目前只作为科研检测工具，无药物开发方向。
注意事项
冻干品 - 20℃避光密封保存，避免反复冻融；储备液常用 DMSO 配制，避免水溶液长期放置自发水解；缓冲体系推荐中性偏弱碱性（pH7.0–7.8），适合 TOP 活性；避光操作，Mca 荧光基团见光易衰减；仅用于体外生化实验，不可用于人体。
