Bartels Mikrotechnik 负压驱动微流控芯片的液滴尺寸动态调控与表征(Michael Bartels)

将细胞或生物分子样品分隔到单分散反应微容器中的液滴微流控技术，为化学、生物分析与筛选带来独特优势。核心优势包括检测通量提升；微小反应体积可降低稀释效应，进而提高检测灵敏度；同时能够最大限度减少试剂与样品消耗。

液滴微流控是一种多功能、高通量平台技术，可在不互溶氟化油相中生成皮升至纳升级的水相液滴。Novec HFE-7500 等氟化油具备多项优良特性，例如高气体溶解度，并且可搭配生物相容性表面活性剂，因此成为生物检测的首选介质。这类生物相容性表面活性剂通常由疏氟亲水的聚环氧乙烷头部基团与亲氟疏水尾部构成。该两亲特性使表面活性剂富集于两相界面，通过降低表面张力来稳定亚稳态液滴，避免液滴融合。液滴可在长时间孵育、较高温度条件下保持稳定。

研究人员已开发大量基于液滴微流控的检测与应用体系。单细胞检测、液滴 PCR、病毒检测等众多应用，证明该平台功能多样，可定制化搭建实验流程。整套微流控工作流由多项单元操作依次组合而成，例如依次完成液滴生成、分裂、分选。依托微流控的流体调控能力，几乎每一项独立单元操作都配有专门优化的微流控芯片。此外，芯片设计与流量调控技术持续发展，进一步拓展了该技术的应用范围。

近年来，微流控液滴被探索用于组织工程领域，例如球体组装、水凝胶包埋，在干细胞分化相关研究中也逐渐受到关注。这类应用所使用的液滴尺寸通常大于单细胞研究所用液滴，以便包埋足量细胞，或是保证充足营养供给，实现液滴内多日细胞培养，维持细胞活性。为解决规模化制备需求，研究人员此前报道了一套自动化工作流，利用液体处理机器人在微流控液滴中高通量制备细胞球体；还搭建了基于深度神经网络表征球体形态的制备优化流程。

水相液滴在连续相中存在多种主动、被动生成方法，其中流动聚焦式液滴生成应用最为广泛。负压液滴生成技术，是在芯片出口端施加低于环境压力的压力源驱动液滴形成。正压或流体驱动的流动聚焦液滴生成技术已得到大量研究，包含芯片几何结构、流态对液滴尺寸的影响分析；但负压操作模式受到的关注相对较少。可以推测，流体基本规律仍然适用，但流体阻力等参数的影响会更加显著。关键区别在于：正压 / 流体驱动模式下，分散相与连续相流速可直接独立调控；而负压液滴生成中，两相流速并非独立输入参数。

但负压液滴生成相比传统正压驱动方法具备几项核心优势。该方法从收集出口端驱动流体，油相入口与样品入口可持续开放，能够对接液体处理机器人，实现自动化操作。相比于注射泵驱动的液滴生成，上述优势更加突出，还可大幅缩短设备搭建与实验周转时间。整套系统可在数分钟内生成数十万个液滴，每一个液滴都是独立分隔的反应容器；样品可在入口储液池中持续搅拌，避免颗粒团聚、条带化与沉降，对于哺乳动物细胞这类敏感生物样品尤其有利。

哺乳动物细胞培养依赖无菌环境，且细胞本身较为敏感：部分细胞，尤其是原代细胞或干细胞，长时间暴露在低于生理温度的环境中会产生不良反应。此外，部分抗生素具有光敏性，因此培养箱外的实验操作必须快速完成。由此，所有细胞处理步骤都应快速进行，设备需要能够放置在生物安全柜这类狭小空间内，缩短实验周转时间。这一点不仅适用于冻存、复苏、传代等常规细胞培养操作，对于微流控操作要求更高 —— 细胞还需要承受剪切力等额外应激。多家商用厂商可提供体积相对小巧的压力控制器件，在微流控领域广泛使用。但这类设备仍需要外接电源、压力源等配套基础设施。对于专注微流控方向的课题组而言，这并非难题；但对于缺少相关经验、想要引入微流控技术的实验室，会增加实验复杂度，形成技术门槛。

因此，拥有完善设备与专业技术的实验室可以完成液滴生成、孵育、进样、分裂、分选等一系列操作。但设备缺乏标准化，且实验装置体积庞大、多为定制化，限制了这项强大技术在更多实验室中的推广。这造成了技术可行性与实际易用性之间的断层：一方面限制了受益于微流控工具的相关研究发展，另一方面也阻碍液滴微流控领域科研人员了解生物使用者的实际需求。

为让非专业实验室也能使用液滴微流控技术，研究人员搭建并全面表征了一套简易液滴生成装置。整套装置仅采用低成本商用设备，降低使用门槛。通过在系统出口与入口施加可变负压驱动液体，仅依靠单一通道几何结构，即可大范围调控液滴尺寸，动态改变液滴组分。这套装置可按需调节液滴生成速率、尺寸与组分，功能丰富，同时整体体积小巧。研究人员进一步将原代肝细胞包埋于液滴中制备细胞球体用于筛选，验证装置实用性。结果表明，该装置可满足广大生物医学科研群体的需求，推动微流控工作流的普及；例如降低筛选实验成本，助力医疗技术普惠化。

2.1 液滴生成装置

本研究测试并搭建三套不同实验装置（图 1）。简要来说，单泵系统可通过调节收集泵施加压力，实现有限的液滴尺寸调控；在连续相储液池额外增加第二台泵，可拓展液滴尺寸调节范围（图 1A）。

图 1. 简易液滴生成装置示意图。(A) 单泵与双泵配置示意图，展示单泵或双泵运行时组件装配方式；在连续相储液池增加第二台泵，可生成更大尺寸液滴。(B) 三泵配置示意图，展示三泵运行时组件装配方式。数字编号对应配件清单。管路长度可自定义，本实验中 7 号管路长度 3 cm，8 号管路长度 5 cm，管路预留足够重叠段保证密封。收集注射器可选用任意鲁尔锁接口注射器。

实验所用微流控芯片为 Fluidic 163，通道深度 175 µm，水相与油相通道宽度均为 140 µm。在交汇口下游 200 µm 处，通道拓宽至 420 µm。在分散相储液池连接两台泵，可按需动态调节液滴组分。全部微流控组件如图所示，详细配件清单见附录。连接泵体的储液池盖子使用圆形封口膜密封，防止漏气。整套装置便携，占地面积紧凑。

深圳市富临神通科技有限公司是 Bartels Mikrotechnik中国代理商，我们在微流控领域拥有丰富经验。我们为客户提供：压电微型泵。

2.2 泵体表征

mp-gas + 隔膜泵通过 PEEK 微流控管路连接压力单元 S，使用 OxyGEN 软件记录压力。频率响应测试区间为 50~800 Hz，步长 10 Hz；振幅响应测试区间 18~250 AU，步长 2 AU。

2.3 液滴生成速率测量

连续相选用 Novec HFE-7500 氟化油，添加质量体积分数 2% 的 008 表面活性剂。水相使用浓度 20 µM 荧光素溶于磷酸盐缓冲液。

微流控芯片按照图 1A 连接管路。单泵体系：收集出口的 Bartels Mikrotechnik mp-gas + 泵设置负压 4.61–13.78 kPa。双泵体系：收集泵负压固定为 13.78 kPa，连接油相入口的 Bartels Mikrotechnik mp-gas + 泵负压设置 0.3–1.4 kPa。

将 514 nm 激光聚焦于喷嘴下游通道拓宽位置，使用光电倍增管采集荧光发射信号，基于定制 LabView 程序记录荧光信号。

2.4 液滴尺寸测量

微流控装置搭建方式同 2.3。生成乳液后，在鲁尔 T 型接头连接注射器手动抽吸，排空收集腔。使用 Ti-E Eclipse 显微镜拍摄乳液图像，ImageJ 软件手动测量液滴尺寸。

2.5 流速测量

装置搭建同 2.3。启动泵体收集乳液；运行 2 min 后关停泵体并断开管路，消除压力差。使用 Zerostat 3 防静电枪按照已有文献方法破乳，将两相分装至不同离心管。使用高精度天平称量样品质量，结合两相密度计算体积（水相：1000 kg/m³，连续相：1614 kg/m³）。

2.6 负压液滴生成数值模拟

为数值模拟仅在收集出口施加负压的流动聚焦液滴生成过程，在 COMSOL Multiphysics 软件中建立喷嘴区域二维近似模型，输入水与 Novec HFE-7500 对应的密度与动力黏度。虚拟通道边界采用亚克力材料，接触角设置为超疏水 0 rad，排除润湿效应。模拟从施加压差起的前 1.25 s，时间步长 5 ms。模拟使用 2020 款 M1 芯片 Macbook Pro，内存 16 GB。

2.7 液滴组分调控

连续相与 2.3 保持一致。水相 1：20 µM 荧光素溶于磷酸盐缓冲液；水相 2：15 µm Fluoro-Max 红色干荧光颗粒分散于超纯水。

芯片管路连接方式见图 1B。连接水相储液池的 Bartels Mikrotechnik mp-liq 泵动态调控：一台泵振幅由 24 AU 上调至 118 AU，另一台同步反向由 118 AU 下调至 24 AU。收集出口连接 Bartels Mikrotechnik mp-gas + 泵，负压设置为−13.8 kPa。Ti-E Eclipse 显微镜拍摄乳液，ImageJ 软件分析。手动统计液滴荧光中位数与颗粒数量。

2.8 细胞球体制备

按照厂商说明书复苏一管冻存原代肝细胞，重悬于 Williams E 培养基，添加青霉素 - 链霉素 (100 U/mL)、L - 谷氨酰胺 (200 mM)、胰岛素 (10 µg/mL)、0.1 µM 地塞米松、5.5 µg/mL 转铁蛋白、10.95 ng/mL 亚硒酸钠，细胞终浓度 7 × 10⁶ 个 /mL。取 400 µL 含细胞培养基，采用单泵体系变体包埋于添加 2% w/v 008 表面活性剂的 Novec HFE-7500 氟化油中，泵运行频率 560 Hz，振幅 250 AU。细胞上样腔内置 3 mm 磁力搅拌子，水相储液池放置在层流柜内旋转磁力驱动器上。液滴生成完成后，将乳液转移至 5 mL 注射器，竖直放置于细胞培养箱（5% CO₂、100% 湿度）孵育；注射器连接 Minisart 5 µm 滤膜，用于气体交换。分别在乳液转移后即刻、孵育 48 h 取样。孵育 48 h 后，使用 PTFE 滤膜破乳回收球体，采用已报道实验方案。统计球体数量，重悬于新鲜培养基，按照每孔 20 个球体接种至 384 孔板。

2.9 活性检测

采用 CellTiterGlo 试剂盒检测细胞活性。取 40 µL 标准品或含球体培养基，加入 30 µL CellTiterGlo 试剂，37 °C 孵育 1 h，EnSight 多功能酶标仪读取信号。

2.10 白蛋白分泌检测

检测白蛋白水平定量白蛋白分泌量。取 40 µL 上清液−20 °C 冷冻保存；采用人白蛋白 LANCE Ultra TR-FRET 检测试剂盒，按照厂家说明书在 EnSight 酶标仪上完成检测。

3.1 泵体表征

为表征负压装置中的微型驱动泵，研究人员在 50–800 Hz 频率区间与 0–250 AU 振幅区间，测试膜片在不同设置下泵体压差响应。振幅 150 AU 与 250 AU 时，微型泵可输出−2.8 kPa 至−13.7 kPa 压差；最大压差在振幅 250 AU、频率区间 525–575 Hz 下获得（图 2A）。值得注意：低频区间压力输出波动更大。基于此，同时考虑最大可实现压差，研究人员重点考察 560 Hz 与 800 Hz 两个频率。

图 2. 泵体表征。(A) 固定振幅（150 AU、250 AU），不同频率下微型泵压力输出；(B) 固定频率（560 Hz、800 Hz），不同振幅下微型泵压力输出。最大压力输出在振幅 250 AU，频率 525~575 Hz 区间获得。

微型泵压差输出呈现阶梯式响应，振幅调制步长 8 AU。所有测试泵在振幅≥17 AU 时均可测得负压。800 Hz 条件下，高振幅区间压差增量相比 560 Hz 更加平缓（图 2B）。研究人员推测，高频会限制产生压力的膜片行程，从而降低有效振幅。基于以上结果，后续全部实验选定 560 Hz 作为运行频率，依靠振幅参数控制泵输出。固定微型泵驱动频率后，压力调节步长可达 0.5 kPa。

3.2 液滴生成特性表征

3.2.1 单泵运行

为理解入口储液池开放、仅收集出口施加负压时液滴生成规律，研究人员使用 COMSOL Multiphysics 开展数值模拟。为控制计算资源与耗时，仅建立喷嘴区域二维近似模型。设置表面张力系数 2 mN/m；水相密度 1000 kg/m³、动力黏度 1 mPa・s；氟化油密度 1614 kg/m³、动力黏度 1.243 mPa・s。接触角设置 0 rad，消除润湿现象。

模拟结果表明：出口压差增大，液滴尺寸减小，液滴生成频率上升。也就是液滴体积随生成速率升高而降低。值得注意，生成速率上升幅度大于液滴体积下降幅度，导致水相总流量上升。油相流量受高压差影响更小，最终水油两相整体比例升高（图 3）。

图 3. 出口施加不同负压条件下微流控液滴生成行为模拟。(A) 各入口流体流量。液滴断裂过程中各入口流量呈振荡特征；施加压差越大，液滴生成速率越高。图 (1)(3)(5) 为油流量最小值时刻喷嘴快照；图 (2)(4)(6) 为油流量最大值时刻喷嘴快照。(B) 液滴即将断裂前的形态。(C) 三组模拟压差条件下，归一化至连续油相流量的分散水相流量，表明负压升高，水油流量比上升。

研究人员利用单泵装置，通过微流控实验验证数值模拟规律，观察到一致趋势：仅依靠收集出口单泵制备乳液时，液滴生成速率随压差增大而升高，液滴体积与之负相关。该规律与滴流区正压生成现象一致：流量升高，液滴尺寸减小。油相流量同样上升，但增幅低于水相，水油体积比从−4.6 kPa 条件下 0.1 升高至−13.8 kPa 条件下 0.6。该体系可生成 3.1 nL~5.3 nL 液滴，对应生成速率 560 Hz~114 Hz（图 4A,B）。装置从零启动运行 2 min，分别称量两相质量（图 4C）。

图 4. 单泵液滴生成。(A) 在收集出口施加不同负压得到乳液代表性图像；白色比例尺 100 µm。(B) 测试压力对应的液滴生成速率、液滴体积、两相流量、水油比。液滴生成速率增幅高于液滴体积降幅。(C) 运行 2 min 后称量产物得到流量测量结果。出口负压升高主要提升水相流量，最终使水油比上升。

测得的水相体积低于基于液滴速率、液滴体积的理论计算值：−4.6 kPa 条件下理论 36 µL，实测 15 µL；−13.8 kPa 条件下理论 103 µL，实测 93 µL。研究人员将该偏差归因于流体初始平衡过程。氟化油密度更大，系统无压力时，水相被推回储液池；只有在出口施加负压后，水相重新进入芯片向下游流动。低压差条件下该过程耗时更长，因此偏差达到 59%；而−13.8 kPa 组偏差仅 9%。

基于微流控芯片通道尺寸，研究人员估算液滴生成芯片的通道相对阻力。按照厂家参数，通道高度 175 µm，计算交汇口前油相通道总阻力约 32 kPa・m⁻³・s⁻¹，水相通道总阻力约 30 kPa・m⁻³・s⁻¹。

水相中没有大量聚合物，可认为两相均为牛顿流体。HFE-7500 氟化油存在极微弱非牛顿特性；但该效应需要极高剪切力才能显著体现，在本实验条件下可忽略。若仅由上述条件控制，两相流量比例应恒定。但实验观测到流量比随压差变化，与数值模拟结果一致。和前人研究结论吻合：出口压差∆p 增大时，水相流量增幅高于连续油相。−4.6 kPa 下水油流量比 0.11；−13.8 kPa 下升高至 0.61，重现二维模拟趋势。研究人员认为该现象源于喷嘴界面拉普拉斯压力：水相入口与水油界面之间有效压差∆pa eff 会被平衡表面张力所需的拉普拉斯压力抵消。出口压力降低时，∆pa eff 的下降速率高于喷嘴入口至界面压差∆po（∆pnz）的变化速率。流量 Q 与这些压差的导数成正比，因此观测到两相流量比值改变（图 5）。

图 5. 微流控系统内压力分布。(A) 微流控回路示意图，标注各段压差，两条油相通道合并为一条。红色代表水相，蓝色代表连续相。(B) 沿通道几何结构的理想压力分布。实际∆plp 并非恒定，但变化极小，本研究中可忽略。

拉普拉斯压力 plp 定义：

\(p_{lp}=\frac{2\gamma}{r}\tag{1}\) γ 代表表面张力，r 代表界面曲率半径。

水相与油相流量 Qa、Qo 同时取决于压差与对应流体阻力：

\(Q_a=\frac{(\Delta p_{nz}-\Delta p_{lp})}{R_a}\tag{2}\)

\(Q_o=\frac{(\Delta p_{nz}-\Delta p_{Pump})}{R_o}\tag{3}\) 式中∆pnz：入口至喷嘴水油界面的压差；∆plp：界面两端压差；Ra：入口至界面水相通道阻力；pPump：泵施加压力；Ro：入口至界面单条油相通道阻力。

联立公式 (2)(3) 得到流量比公式 (4)：

\(\frac{Q_a}{Q_o}=\frac{(\Delta p_{nz}-\Delta p_{lp})}{R_a}\cdot\frac{R_o}{\Delta p_{nz}}=\frac{R_o}{R_a}\cdot\left(1-\frac{\Delta p_{lp}}{\Delta p_{nz}}\right)\tag{4}\)

微流控通道流体阻力不变，两个入口开放通大气压；近似认为拉普拉斯压力恒定。由此可以得到结论：∆pnz 随 pPump 降低而增大，水相与连续相流量比随之上升。

当压差低于约−3 kPa 时，这套单泵装置无法继续生成液滴，推测同样由拉普拉斯压力导致。因此，想要降低油相消耗、提升水相处理通量、获得更大液滴（例如球体制备），需要采用其他方案。

3.2.2 尺寸调控双泵装置

在供给油相入口的油储液池增加一台反向泵，降低有效压差，可调节油相流量，进而调控液滴尺寸。收集泵振幅固定 250 AU，输出−13.8 kPa；油储液池连接泵负压在−0.3~−1.4 kPa 区间调节，超过−1.4 kPa 后油通道断流，仅收集水相。通过该方式，液滴体积最高可提升至 21 nL，对应直径 340 µm。水相流量基本稳定维持在 90 µL・min⁻¹，油相流量从 143 µL・min⁻¹ 持续下降至 43 µL・min⁻¹。该配置下，液滴体积增长速率与液滴生成速率下降呈线性相关，最终水相流量基本恒定（图 6）。该结果与已有文献结论一致：流动聚焦孔道芯片的液滴尺寸由通道几何与连续相流量共同决定。

图 6. 双泵配置液滴生成。(A) 出口固定−13.8 kPa，油储液池施加不同负压得到乳液代表性图像；黑色比例尺 100 µm。(B) 油储液池不同负压对应的液滴速率、体积、两相流量。油储液池负压增大，液滴生成速率降低，液滴体积增大；水相流量基本不受影响，油相流量下降。

3.2.3 组分调控三泵装置

为进一步验证装置多功能性，搭建三泵体系：一台收集泵，两个水相入口各配置一台反向泵。以 1.5 × 10⁶ 颗粒悬浮液作为高浓度哺乳动物细胞样品模型，磷酸盐缓冲液溶解的荧光素作为第二种待包埋水相组分。振幅超过 118 AU 时，流体会从交汇口流向泵驱动的水相入口，因此将 118 AU 作为上限；依次调节两台泵振幅从 118/0 至 0/118（图 7A）。这套方案无需更换样品，即可快速生成具有多种组分的乳液（图 7B,C）。

图 7. 水相入口双泵调控液滴组分。(A) 两种不同水相样品动态混合的多组泵设置示意图。(B) 单个液滴绿色荧光中位数与颗粒含量的散点图。(C) 用于获得该结果的 4 组乳液代表性图像，两个荧光通道叠加合成图；白色比例尺 100 µm。

3.2.4 生物安全柜内单泵装置制备微组织

最后，研究人员验证这套简易液滴生成装置在哺乳动物细胞培养所需无菌环境下处理生物样品的实用性。该简易液滴发生器几乎无需培训，非专业人员即可操作，占地面积小，搭建迅速。泵运行频率 560 Hz、振幅 250 AU。研究人员包埋人原代肝细胞，液滴内孵育 48 h 后成功组装形成细胞球体（图 8A–C）。整个孵育周期内细胞保持高活性；后续转移至 GrowDex 基质继续孵育 120 h，ATP 水平上升提示细胞增殖（图 8D）。

图 8. 微流控液滴可支持原代细胞形成功能性细胞球体。(A–C) 简易液滴装置生成微流控液滴，包埋原代细胞后形成球体的明场代表性图像；白色比例尺 100 µm。(A) 原代肝细胞包埋后即刻的乳液。(B) 注射器内 37 °C、5% CO₂、100% 湿度孵育 24 h 后的乳液。(C) 孵育 24 h 破乳后的球体，证明细胞聚集体结构完整。(D) ATP 浓度作为活性指标的曲线图。从复苏、液滴孵育 48 h 直至破乳，细胞活性维持稳定；转移至 GrowDex 继续孵育 120 h 后，ATP 表征的细胞活性上升，提示细胞增殖。(E) 白蛋白定量检测对比：简易装置液滴制备原代肝细胞球体，与超低吸附板制备球体，样品来自两名不同供体。全部样品检测时间点为 7 天（液滴球体：液滴内孵育 48 h + GrowDex 孵育 120 h；超低吸附板样品：板内孵育 168 h）。两组测试案例中，微流控液滴组装球体的白蛋白分泌水平更高。***代表 p<0.001，** 代表 p<0.01，代表 p<0.05，ns 代表无统计学差异，采用单因素方差分析。

白蛋白分泌是人原代肝细胞功能的标志性指标，并非所有培养模型都能维持该功能。对比超低吸附培养板制备的球体，白蛋白定量检测结果表明微流控液滴来源球体白蛋白分泌水平更高（图 8E）。综合以上结果，微流控液滴制备球体可用于药物、毒性筛选等下游实验。

本研究搭建并表征一套低成本、占地面积小的液滴生成装置，使用 1~3 台小型 Bartels Mikrotechnik 隔膜泵。这套模块化装置可生成单分散液滴，覆盖宽尺寸区间，并且可以动态调节液滴组分。所有零部件均可商用购买、方便替换。装置不需要专用微流控实验室基础设施，几乎可以在任意地点搭建。所有与样品接触的组件均可灭菌；整套设备足够紧凑，能够放置在生物安全柜这类无菌环境。研究人员将装置放置在二级生物安全细胞培养柜，包埋高敏感性原代细胞，实现液滴辅助球体成型，完成验证。

这套简易液滴生成装置，为生命科学领域非专业用户使用高端液滴微流控技术降低了门槛。生命科学实验室部署这类低成本、易获取的微流控设备，能够带来全新研究视角，催生新的技术开发方向与应用场景。