血液黏度受多种因素影响，包括红细胞变形性、血细胞比容以及血浆蛋白水平。若要有效区分各因素的单独作用，就需要同步测量血液与血浆的黏度。本研究采用超声换能器实现血浆分离，并利用共流微流控通道开展黏度检测，依次测得悬浮血液与血浆的黏度。为提升黏度测量精度，通过实验与数值模拟得到校正系数，并将其代入黏度解析表达式。为稳定微型泵产生的脉动血流，将频率 (f) 与电压 (v) 分别设置为 f = 300 Hz、v = 140 任意单位。将柔性聚乙烯管路（内径 500 微米，长度 40 毫米）连接至微流控芯片，用作空气阻尼器。最终，血流速度的变异系数最多可降低 1%。作为验证实验，将正常红细胞加入自体血浆，配制血细胞比容分别为 20%、30%、40% 的悬浮血液。相较于以往方法，本方法对两种流体的黏度测量结果均存在高估（悬浮血液高估 14%~25%，血浆高估 7%~21%）。该方法可依次完成悬浮血液和血浆的黏度测量。这套集成系统能够简化血液处理流程，包括采血、将血液装入注射器以及把注射器安装至注射泵等操作。
一、引言血液由血细胞（即红细胞、白细胞和血小板）以及血浆组成。红细胞在毛细血管与外周组织之间的气体（氧气或二氧化碳）传输过程中起到关键作用。红细胞约占血液体积的 40%~50%，相较于其余血细胞，被认为是决定血液黏度的核心因素。换言之，血液黏度主要由红细胞力学表型或血细胞比容（Hct）决定。多项生物力学因素会造成血液黏度变化，包括液双层黏弹性、细胞质黏度以及红细胞表观形态。但血细胞比容会使血液黏度显著升高。血液黏度对微循环内的血流以及受限血管内部的压降存在明显影响。除红细胞外，血浆同样会造成血液黏度上升。已有研究表明，血液黏度可为多种疾病的监测与诊断提供有效信息。近年来，血液黏度检测被用于诊断高黏滞综合征、血液凝固以及红细胞储存损伤。
与传统大体积检测设备相比，微流控平台具有样品消耗量小、实验周期短、响应迅速、灵敏度高等独特优势。目前已经提出多种测定血液黏度的方法。根据经典泊肃叶方程（即压降 = 流阻 × 流量），可通过测量压降或流量得到流阻。在矩形微流控通道中，流阻与血液黏度成正比。原理上，通过定量测定流阻即可获得血液黏度，尤其是在固定流量或者固定压降条件下。已有研究提出多种流阻测量方案（共流通道内界面位置、数字流体腔、液滴长度）或者压降测量方案（气液界面移动、薄膜形变），用于获取血液黏度。上述方法将血液（或血浆）通入微流控通道，以此测定血液或血浆黏度。全血（或悬浮血液）黏度受红细胞变形性、血细胞比容、血浆蛋白等多种因素共同影响，需要厘清各个因素的贡献。因此，有必要单独分离各因素的作用效应。然而，现有大多数方法仅关注在微流控芯片内精准测量血液黏度，难以同时测定全血（悬浮血液）与血浆的黏度。为解决该问题，需要将血浆从血液中分离，再依次将两种液体通入微流控器件，随后采用研究人员报道的共流法测定两种流体的黏度。当血液与参比流体按特定流量比通入通道时，两种流体之间的界面位置由二者黏度比决定。参比流体黏度预先已知，因此可通过定量测量共流通道内血液占据的通道宽度计算血液黏度。
本研究在微流控芯片中结合超声换能器与共流法，依次测定悬浮血液与血浆的黏度。为顺序完成两种流体黏度检测：第一，不启动超声换能器，利用微泵将悬浮血液从换能器输送至微流控器件，采用共流技术测定血液黏度；第二，超声换能器工作一定时间，在换能器内部完成血浆与红细胞的分离，之后微泵将血浆从换能器输送至微流控器件，再通过共流法测定血浆黏度。
相比于以往研究（采用微泵输送超声腔分离后的悬浮血液与血浆），本方法能够顺序测量血液与血浆黏度。此外，这套集成系统简化血液操作流程（无需从超声腔抽取血液、将血液装入一次性注射器、使用注射泵输送血液），采用微泵系统替代昂贵、体积大的注射泵。
二、材料与方法2.1 血浆分离与黏度测量实验装置
为将血浆从悬浮血液中分离并依次测定血液、血浆各自黏度，研究人员搭建了血浆分离与血流定量检测系统（图 1A）。
图 1. 血浆分离并顺序测定血液与血浆黏度的新方法。(A) 实验装置、血浆分离过程与血液定量检测。(i) 实验装置示意图，包含微流控器件、超声换能器、两台泵（微泵与注射泵）以及图像采集系统。(ii) 随时间推移，悬浮血液中的血浆分离过程（t1 = t0，t2 = t0 + 10 min，t3 = t0 + 10 min，t4 = t0 + 10 min）。(iii) 血液流速 (Ub) 与界面 (αb) 的定量。(B) 悬浮血液（自体血浆悬浮正常红细胞，血细胞比容 Hct=50%）三项参数（界面、图像灰度、血液流速）的定量。(i)αb、Ib、Ub 随时间的变化。首先通入悬浮血液 3 min；随后血液内血浆分离 25 min；再通入血浆 6 min。(ii) 超声腔与显微图像随时间 t 的快照（t = 0、180、1620、2040 s）。
图 1 (A-i) 为实验装置示意图，包含微流控器件、超声换能器、两台泵（输送血液的微泵与输送参比流体的注射泵）以及显微图像采集系统。微流控器件包含两个入口 (a、b)、血液通道（BC，宽度 200 µm）、参比流体通道（RC，宽度 200 µm）、共流通道（CC，宽度 400 µm）与一个出口；所有通道深度统一设置为 50 µm。依据已有研究方案，采用软光刻工艺制备聚二甲基硅氧烷微流控芯片。为稳定微泵产生的脉动血流，在入口 (a) 连接空气阻尼器。空气阻尼器由聚乙烯管（内径 500 µm，长度 Lt）开口端使用钢销封堵构成。
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采用超声换能器分离悬浮血液中的血浆。开启超声换能器后，一级辐射力会驱动分散的红细胞向压力场的波节或波腹移动，移动方向由声学修正系数的符号决定（ϕ > 0：波节；ϕ <0：波腹）。随后二级辐射力与伯努利力持续促使红细胞聚集。当聚集红细胞的重力大于浮力时，红细胞发生沉降，从而在换能器内部实现血浆与悬浮血液的分离。参考已有研究，设置频率 f=2.1 MHz，声功率 AP=2 W。向超声腔装入约 5 mL 悬浮血液。采用 MP6 微泵（Bartels Mikrotechnik）将血液从换能器输送至微流控器件入口 (a)。通过控制器（Quadkey，Bartels Mikrotechnik）设置频率、电压两项参数，调节微泵流量。
根据共流黏度测量方法，参比流体的黏度与流量需要预先确定。本研究选用 1×PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）作为参比流体，使用注射泵设置流量为 1 mL/h。微流控器件安装在倒置光学显微镜上，配备 10 倍物镜（数值孔径 N.A.=0.25）。为定量血液通道内的血流，使用高速相机采集显微图像；相机帧率设置为 5000 帧每秒。全部实验过程中，在外触发信号控制下，每隔 1 s 连续采集两张显微图像。
图 1 (A-ii) 展示超声换能器内血浆分离过程。悬浮血液由正常红细胞加入自体血浆配制，血细胞比容设置为 50%。超声驻波会加速换能器内红细胞沉降，因此血浆体积（高度）随时间显著增加（t1 = t0，t2 = t0 + 10 min，t3 = t0 + 10 min，t4 = t0 + 10 min）。
2.2 血液流速、图像灰度与界面的获取
如图 1 (A-iii) 所示，采用 MATLAB 2022a 软件进行数字图像处理，获取血液通道内血液流速以及共流通道内的流体界面。图 1 血浆分离并顺序测定血液与血浆黏度的新方法。(A) 实验装置、血浆分离过程与血液定量检测。(i) 实验装置示意图，包含微流控器件、超声换能器、两台泵（微泵与注射泵）以及图像采集系统。(ii) 随时间推移，悬浮血液中的血浆分离过程（t1 = t0，t2 = t0 + 10 min，t3 = t0 + 10 min，t4 = t0 + 10 min）。(iii) 血液流速 (Ub) 与界面 (αb) 的定量。(B) 悬浮血液（自体血浆悬浮正常红细胞，血细胞比容 Hct=50%）三项参数（界面、图像灰度、血液流速）的定量。(i)αb、Ib、Ub 随时间的变化。首先通入悬浮血液 3 min；随后血液内血浆分离 25 min；再通入血浆 6 min。(ii) 超声腔与显微图像随时间 t 的快照（t = 0、180、1620、2040 s）。
首先，在血液通道内选定特定感兴趣区域（ROI，200 µm × 550 µm），采用时间分辨微粒子图像测速技术（micro-PIV）获得血液流速场。查询窗口设置为 64 像素 × 64 像素；单个像素对应 3.3 µm，窗口重叠率 75%。根据已有研究给出的解析公式，估算相关深度（DOC）为 64.1 µm。由于相关深度大于通道深度（h=50 µm），假设流速场沿通道深度方向保持不变。对感兴趣区域内全部流速场取算术平均值，得到血液流速 Ub。血液流量由 Qb = Ub × Ac 估算，Ac 为矩形通道横截面积，Ac = 宽度 × 深度。
此外，基于血液通道内同一感兴趣区域，获取血流的图像灰度 Ib。最后，为获取共流通道内的流体界面，在两股流体汇合区域下游选取感兴趣区域（400 µm × 550 µm）。采用大津法将灰度图像转换为二值图像。对感兴趣区域内血液填充宽度的波动取平均，得到血液填充宽度 wb；界面参数 αb 定义为 αb = wb/w。
2.3 本方法的操作流程
为测定悬浮血液与血浆各自黏度，图 1 (B-i) 展示整套实验流程中三个参数（Ub、Ib、αb）随时间的变化曲线。图1血浆分离并顺序测定血液与血浆黏度的新方法。(A) 实验装置、血浆分离过程与血液定量检测。(i) 实验装置示意图，包含微流控器件、超声换能器、两台泵（微泵与注射泵）以及图像采集系统。(ii) 随时间推移，悬浮血液中的血浆分离过程（t1 = t0，t2 = t0 + 10 min，t3 = t0 + 10 min，t4 = t0 + 10 min）。(iii) 血液流速 (Ub) 与界面 (αb) 的定量。(B) 悬浮血液（自体血浆悬浮正常红细胞，血细胞比容 Hct=50%）三项参数（界面、图像灰度、血液流速）的定量。(i)αb、Ib、Ub 随时间的变化。首先通入悬浮血液 3 min；随后血液内血浆分离 25 min；再通入血浆 6 min。(ii) 超声腔与显微图像随时间 t 的快照（t = 0、180、1620、2040 s）。
Ub 与 αb 用于计算各流体黏度；Ib 用于判定悬浮血液或者血浆流入血液通道、共流通道的时间节点。悬浮血液（Hct=50%）由正常红细胞添加至血浆配制。第一阶段（t < 180 s），开启微泵持续向微流控器件通入悬浮血液，测定血液黏度；频率 f=300 Hz，电压 v=140 任意单位。随后关闭微泵，开启超声换能器，实现血液中的血浆分离（180 s < t < 1680 s）。最后关闭超声换能器，再次开启微泵，将血浆输送至微流控器件。
图 1 (B-ii) 为超声腔与显微图像在不同时间 t（t=0、180、1620、2040 s）的快照。t=180 s 之前，悬浮血液通入并进入微流控器件；共流通道内同时存在血液与 1×PBS，超声腔内血液体积逐渐减少。在 t=180 s 至 t=1680 s 区间，持续进行血浆分离。微泵关闭后，所有通道内充满参比流体。t=2040 s 时，血浆进入共流通道。根据这套微泵与超声换能器的操作流程，采集三项参数，依次得到血液、血浆两种流体的黏度。
2.4 悬浮血液样品配制
浓缩红细胞袋采购自韩国光州全南血液中心。浓缩红细胞经 1×PBS 充分洗涤后，将正常红细胞加入自体血浆，配制多种悬浮血液样品。
三、结果与讨论3.1 共流法修正系数的定量测定，用于精准黏度测量
本研究采用共流法顺序测定血液与血浆黏度。根据传统方法，通过检测共流通道内流体界面位置即可计算流体黏度。但是共流法检测性能会随界面位置变化。研究人员引入修正系数，最大限度降低测量误差。已有研究表明修正系数与通道深宽比以及界面位置相关；即重新设计微流控通道时，需要通过实验或者数值模拟获取修正系数。
图 2 (A-i) 将共流通道等效为两个流阻元件进行数学建模。
图 2. 基于流体电路元件推导血液黏度计算公式。(A) 共流通道数学模型。(B) 实验与数值模拟结果定量对比。(i) 界面随流量比 (Qt/Qr) 的变化实验结果（Qt/Qr = 1/0.2、1/0.5、1/1、0.5/1、0.2/1）。(ii) 界面随 Qt/Qr 变化的数值模拟结果。(C) 实验与数值模拟得到的修正系数随界面参数的变化。基于实验结果线性回归拟合，修正系数 CF 拟合公式：CF = 0.7004 αt + 0.6216（R²=0.9469）。
共流通道内充满待测流体（下标 t）与参比流体（下标 r），两种流体的摩擦损失采用流阻元件 Rt、Rr 表示。出口（∇）处压力设置为零，P=0。Qt、Qr 分别代表待测流体、参比流体流量。为简化数学表达，两股流体等效为 Rt 与 Rr，两个流阻元件并联。根据泊肃叶流动方程 ΔP = R × Q，两股流体压力表达式为： Pr = 12 μr L / [(1−αt) w h³] × Qr (1) Pt = 12 μt L / [CF・αt w h³] × Qt (2)
式 (2) 中引入与界面相关的修正系数 CF（CF = CF [αt]），用于补偿对真实物理问题近似带来的数学模型误差。两股流体被限制在平直矩形通道内，在距离出口 L 位置处，两股流体压力相等。
基于等压条件 Pt = Pr，待测流体黏度表达式为： μt = μr × (Qr/Qt) × [αt/(1−αt)] × CF (αt) (3)
本研究中待测流体为血浆，参比流体选用 1×PBS。使用 CFD 求解器 CFD-ACE + 开展数值模拟，设置两种流体黏度比 µt/µr=1.674，模拟 αt 的变化。图 2 (B-i) 汇总不同 Qr/Qt（1/0.2、1/0.5、1/1、0.5/1、0.2/1）条件下表征 αt 的显微图像。图 2 (B-ii) 数值模拟结果以二值色彩直观展示 αt 随 Qt/Qr 的变化。可见 Qt/Qr 增大时，αt 随之上升；实验与数值模拟得到的 αt 随 Qr/Qt 变化趋势一致。
推导修正系数解析公式： CF (αt) = (μt/μr) × [(1−αt)/αt] × (Qt/Qr) (4)
基于式 (4)，图 2 (C) 给出修正系数随界面参数的变化曲线。数值模拟获得的修正系数高于实验测定值。本研究基于实验结果线性回归拟合，得到 CF = 0.7004 αt + 0.6216（R²=0.9469）。将修正系数回归公式代入式 (3)，即可高精度测定血液与血浆黏度。
3.2 血流定量评价与血流稳定化
微泵依靠压电膜振动输送悬浮血液，会使血流产生周期性波动。但测定血液或血浆剪切黏度时，实验过程必须维持恒定流量（流速）。因此，研究人员调整微泵频率，降低血流波动；同时改变空气阻尼器长度（空腔体积），评价空气阻尼器对血流的稳定效果。悬浮血液（Hct=50%）由正常红细胞添加至自体血浆配制。
在不接入空气阻尼器的条件下监测流速 Ub 与界面 αb，定量表征微泵输送的血流。图 3A 给出不同工作频率 f 下界面变化显微图像 ([i] f = 100 Hz，[ii] f = 300 Hz，[iii] f = 400 Hz，[iv] f = 800 Hz)。
图 3. 微泵输送血流定量评价以及空气阻尼器对血流的稳定作用。(A) 显微图像展示界面随工作频率 f 的变化 ([i] f = 100 Hz，[ii] f = 300 Hz，[iii] f = 400 Hz，[iv] f = 800 Hz)。(B) 工作频率对血液流速、流体界面的影响。(i) Ub 随时间的变化（不同频率）。(ii) Ub 与变异系数 COV 随频率的变化。(iii)αb 随时间的变化（不同频率）。(iv)αb 与变异系数 COV 随频率的变化。(C) 空气阻尼器对血流稳定效果。(i) 连接在微流控器件上的空气阻尼器示意图。(ii) Lt=0、20、40、60 mm 条件下 Ub 随时间的变化。(iii) 变异系数 CV 随 Lt 的变化。
微泵激励电压固定为 v=140 任意单位。工作频率升高，αb 呈现下降趋势。基于长时间采集的显微图像，得到 Ub、Ib 随工作频率的时序变化。图 3 (B-i) 展示不同频率下 Ub 随时间变化曲线：f=100 Hz 时，Ub 出现大幅交替波动；频率调整至 300 Hz，波动显著减弱。由此推断微泵共振频率接近 100 Hz；若降低流速波动，工作频率需要设置在 100 Hz 以上。
图 3 (B-ii) 为 Ub 与变异系数 COV（COV = 标准差 / 平均值）随频率变化曲线。随工作频率升高，Ub 逐步下降；COV 在 300 Hz 或 400 Hz 出现最小值。图 3 (B-iii) 为不同频率下 αb 时序变化；频率升高，αb 缓慢下降。αb 波动幅度很小，说明界面基本不随工作频率改变。图 3 (B-iv) 为 αb 与 COV 随工作频率变化曲线；αb 随频率线性降低，COV 小于 1%。结果表明，相比于界面 αb，血液流速 Ub 受工作频率影响显著。基于实验结果，后续实验微泵工作频率设置为 300 Hz。
为降低血流周期性脉动，在入口 (a) 接入空气阻尼器。增加聚乙烯管长度 Lt，调整空气阻尼器内部空腔，增强空气顺应效应。图 3 (C-i) 为接入微流控器件入口 (a) 的空气阻尼器示意图。参比流体（1×PBS）流量由注射泵设置为 1 mL/h；微泵控制参数 f=300 Hz、v=140 任意单位。图 3 (C-ii) 展示 Lt=0、20、40、60 mm 条件下 Ub 时序变化。空气阻尼器能够降低 Ub 的周期性波动。图 3 (C-iii) 为变异系数 CV 随 Lt 变化曲线；接入空气阻尼器后，CV 由 3% 显著下降至 1%。后续实验空气阻尼器长度 Lt 选定为 40 mm。
3.3 不同血细胞比容下悬浮血液与血浆的顺序黏度测量
前述实验已经定量分析关键参数对血液流速、界面的影响。作为方法验证，采用本方法测定悬浮血液与血浆黏度。将正常红细胞加入同一份自体血浆，配制 Hct=20%、30%、40% 的悬浮血液样品；使用相同稀释基质配制样品，以此考察血细胞比容对血液黏度的贡献。
按照本研究提出的操作流程，图 4A 给出不同血细胞比容（[i] Hct=20%、[ii] Hct=30%、[iii] Hct=40%）下 αb、Ib、Ub 随时间的变化。
图 4. 不同血细胞比容下悬浮血液与血浆的顺序黏度测量。(A) Hct=20%、30%、40% 条件下 αb、Ib、Ub 时序变化。(B)µb 随血细胞比容的时序变化。(C) 本方法（微泵输送血液）与以往方法（注射泵输送血液）定量对比。(i) 本方法测得血液、血浆稳态黏度随血细胞比容变化。(ii) 以往方法测得血液、血浆稳态黏度随血细胞比容变化。
对于悬浮血液，血细胞比容越高，Ub 越低；血细胞比容升高会使 αb、Ib 增大。血细胞比容越高，血浆从悬浮血液中分离所需时间越长。微泵开启后，αb 可迅速达到稳态；但 Ub 需要较长时间才能稳定。由此推断，空气阻尼器会造成 Ub 产生时间延迟，而对 αb 影响很小。
基于 αb 与 Ub 时序数据，代入式 (3) 计算悬浮血液与血浆各自黏度。图 4B 给出 µb 随血细胞比容的时序变化曲线。受空气阻尼器动态延迟影响，悬浮血液黏度 µb 大约 120 s 后达到稳态；血液黏度随血细胞比容升高而增大。血浆黏度 µb 可在 60 s 内达到稳态。已有研究表明，时间常数（时间延迟）由流阻与流体顺应性共同决定（时间常数 = 流阻 × 顺应性）。血液黏度高于血浆，因此悬浮血液的时间延迟长于血浆。不同悬浮血液样品分离得到的血浆，黏度无显著差异。
图 4C 为本方法（微泵输送血液）与传统方法（注射泵输送血液）定量对比。本方法中，黏度达到稳态后，取平均值 ± 标准差作为悬浮血液、血浆黏度。传统方法测定悬浮血液黏度时，需要将悬浮血液装入一次性注射器，安装至注射泵，设置血液流量 1 mL/h。估算血流剪切率大于 1000 s⁻¹，因此假定血液为牛顿流体。测定血浆黏度时，从超声腔收集血浆，装入一次性注射器，安装注射泵，血浆流量设置为 1 mL/h。
与传统方法相比，本方法无需将血液装入一次性注射器，以微泵替代注射泵。图 4 (C-i) 为本方法测得血液、血浆稳态黏度随血细胞比容变化；图 4 (C-ii) 为传统方法测得血液、血浆黏度随血细胞比容变化。正如预期，血液黏度随血细胞比容线性上升（R²=0.98）；血浆黏度基本保持恒定（R²=0.17~0.46）。与传统方法相比，本方法测得两种流体黏度偏高：悬浮血液高估约 14%~25%，血浆高估约 7%~21%。两种方法仅在血液输送方式上存在差异（传统方法：注射泵；本方法：微泵）。已有研究表明，血细胞比容显著影响血液流速。因此推测 micro-PIV 技术低估了血流流量；对于悬浮血液，需要延长输送时间，保证 Ub 进入稳态区间。
由实验结果可得出结论：本方法能够顺序测定悬浮血液与血浆黏度；简化血液处理操作（血液采集、装样），以微泵替代注射泵。
四、结论本研究在微流控器件中结合超声换能器与共流法，顺序测定悬浮血液与血浆黏度。整套操作流程如下：第一，通入悬浮血液，采用共流技术测定血液黏度；第二，利用超声换能器从悬浮血液中分离血浆；第三，通入血浆，测定血浆黏度。为提高共流法测量精度，通过实验与数值模拟计算修正系数。基于关键参数定量研究，微泵控制参数设定为频率 f=300 Hz，电压 v=140 任意单位。此外，采用空气阻尼器（内径 500 µm，长度 40 mm），血液流速变异系数 COV 优化至 1%。
方法验证实验：将正常红细胞添加至同一份自体血浆，配制 Hct=20%、30%、40% 悬浮血液。实验结果显示，血液黏度随血细胞比容呈线性增加；由于所有悬浮血液使用相同稀释基质，血浆黏度基本不变。对比传统输送方案，本微泵输送方案测得两种流体黏度存在高估，悬浮血液高估约 14%~25%，血浆高估约 7%~21%。基于解析模型分析，该偏差源于血液流速被低估。后续研究需要优化 micro-PIV 技术的血液流速定量算法；同时进一步优化微泵操作流程，保障稳定血流供给。
