带新人的时候我发现，冻存这件事最难教的不是原理，是顺序。哪一步该在冰上、哪一步不能省、哪一步多做十秒就出事，这些没人写成文字。
这份流程可以直接打印出来贴在超净台旁边。
冻存前一天
确认细胞状态。冻存前 24 小时换一次新鲜培养基，让细胞处在对数生长期。刚传代就冻、或者长过头再冻，复苏效果都不一样。
准备好耗材：冻存管、记号笔、冻存液、程序降温盒（如果使用）、冰盒。冻存液提前从四度取出回温到室温，不要直接用冰的。
冻存当天，按顺序来
第一步，消化。按你日常传代的酶浓度和时间来，不要为了多收细胞而延长消化。过度消化带来的膜损伤，冻存时看不出来，复苏时才暴露。
第二步，计数。这一步不能省。密度是冻存里最容易被忽略又最影响结果的参数，常规建议 5×10^5 到 1×10^7/mL。悬浮细胞偏上限，贴壁细胞可以中段。
第三步，离心去上清。转速按细胞类型，一般 200 到 300 xg、五分钟。上清要尽量吸干净，残留的酶和旧培养基会稀释冻存液。
第四步，重悬。用冻存液重悬，动作轻，避免反复吹打产生气泡。重悬后尽快分装，不要在室温放着排队。
第五步，分装。每管一到一点五毫升，不要装满到瓶口，留出冻存膨胀的空间。拧盖之后再回松四分之一圈，很多冻存管说明书里写了这一条，但很少有人做。
第六步，标记。管身写细胞名称、代次、密度、冻存日期、操作人。用耐低温记号笔，或者贴标签后加一层透明胶。液氮里泡过的字，普通记号笔是撑不住的。
第七步，降温。用程序降温盒的，确认异丙醇液位和更换周期；不用降温盒的，选支持一步法冻存的配方，直接放负八十。无论哪种，负八十只过夜，不要长期存放。
第八步，转液氮。第二天转到液氮，并在记录表上写下转入时间。这一行字，是后面所有追溯的起点。
七个容易被忽略的细节
冻存液不要反复冻融，开封后按说明书期限内用完。
DMSO 相关操作尽量在冰上或四度完成，室温停留越短越好。
同一批实验的冻存管，尽量同一天、同一人、同一盒完成。
降温盒不要塞太满，也不要只放一支。
负八十冰箱不要频繁开门，尤其是刚放进去的那几个小时。
复苏时水浴温度要真的到 37℃，不是"感觉温了"。
复苏后是否去除冻存液，按配方说明来，通用型配方通常建议洗一次。
关于冻存液的选择
如果实验室细胞类型比较杂，从小鼠成纤维到 HEK293 到各种肿瘤细胞系都有，选一款通用型配方能省掉很多沟通成本。BA3309 就是按这个场景做的：开盖即用，不需要自己配 DMSO 和血清比例，批间稳定性是我们投入最多的部分。
需要提醒的是，通用不等于万能。原代细胞、干细胞、类器官这类敏感样本，建议先做小规模验证，再决定是否沿用通用配方。 把这份流程存下来，下次带新人可以直接甩链接。
